RNA-seq比对软件HISAT说明书

取代bowtie tophat进行RNA-seq比对

HISAT全称为Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts,由约翰霍普金斯大学开发。它取代Bowtie/TopHat程序,能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对。这项成果发表在3月9日的《Nature Methods》上。

HISAT利用大量FM索引,以覆盖整个基因组。以人类基因组为例,它需要48,000个索引,每个索引代表~64,000 bp的基因组区域。这些小的索引结合几种比对策略,实现了RNA-Seq读取的高效比对,特别是那些跨越多个外显子的读取。尽管它利用大量索引,但HISAT只需要4.3 GB的内存。这种应用程序支持任何规模的基因组,包括那些超过40亿个碱基的。

HISAT软件可从以下地址获取:http://ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml。

首先,我们安装这个软件!

Wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat/downloads/hisat-0.1.5-beta-source.zip

官网下载的是源码包,需要make一下,make之后目录下面就多了很多程序,绿色的那些都是,看起来是不是很眼熟呀!!!

哈哈,这完全就是bowtie的模拟版本!!!

RNA-seq比对软件HISAT说明书

也可以从github里面下载,wget https://codeload.github.com/infphilo/hisat/zip/master

下载后直接解压即可使用啦。当然这个软件本身也有着详尽的说明书

http://ccb.jhu.edu/software/hisat/manual.shtml

然后就是准备数据,它跟tophat一样的功能。就是把用RNA-seq方法测序得到的fastq文件比对到参考基因组上面,所以就准这两个文件了哦

接下来是运行程序!

说明书上面写着分成两个步骤,构建索引和比对。

这个软件包模仿bowtie自带了一个example数据,而且它的说明书也是针对于那个example来的,我也简单运行一下。

$HISAT_HOME/hisat-build $HISAT_HOME/example/reference/22_20-21M.fa 22_20-21M_hisat

构建索引的命令如上,跟bowtie一样我修改了一下

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build 22_20-21M.fa  my_hisat_index

连日志都跟bowtie一模一样,哈哈,可以看到我们的这个参考fasta文件 22_20-21M.fa 就变成索引文件啦,索引还是很多的!

RNA-seq比对软件HISAT说明书

然后就是比对咯,还是跟bowtie一样

$HISAT_HOME/hisat -x 22_20-21M_hisat -U $HISAT_HOME/example/reads/reads_1.fq -S eg1.sam

我的命令是

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat -x  my_hisat_index -U ../reads/reads_1.fq  -S reads1.sam

1000 reads; of these:

1000 (100.00%) were unpaired; of these:

0 (0.00%) aligned 0 times

1000 (100.00%) aligned exactly 1 time

0 (0.00%) aligned >1 times

100.00% overall alignment rate

哈哈,到这里。这个软件就运行完毕啦!!!是不是非常简单,只有你会用bowtie,这个就没有问题。当然啦,软件还是有很多细节是需要调整的。我下面就简单讲一个实际的例子哈!

首先,我用了1.5小时把4.6G的小鼠基因组构建了索引

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build  Mus_musculus.GRCm38.fa.fa mouse_hisat_index

RNA-seq比对软件HISAT说明书

然后对我的四个测序文件进行比对。

for i in *fq
do
/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat  -x  /home/jmzeng/hoston/mouse/mouse_hisat_index  \
-p 30 -U  $i.trimmed.single  -S ./hisat_out/${i%.*}.sam
done

它运行的速度的确要比tophat快好多,太可怕的速度!!!!至于是否多消耗了内存我就没有看了

4.6G的小鼠,5G的测序数据,我只用了五个核,居然十分钟就跑完了!

然后听群友说是因为没有加 –known-splicesite-infile 这个参数的原因,没有用gtf文件来指导我们的RNA数据的比对,这样是不对的!

需要用下面这个脚本把gtf文件处理一下,然后导入什么那个参数来指导RNA比对。

extract_splice_sites.py genes.gtf > splicesites.txt

但是我报错了,错误很奇怪,没解决,但是我换了个 extract_splice_sites.py  程序,就可以运行啦!之前是HISAT 0.1.5-beta release 2/25/2015里面的python程序,后来我换做了github里面的就可以啦!

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-master/extract_splice_sites.py Mus_musculus.GRCm38.79.gtf >mouse_splicesites.txt

RNA-seq比对软件HISAT说明书

21192819 reads; of these:

21192819 (100.00%) were unpaired; of these:

14236834 (67.18%) aligned 0 times

5437800 (25.66%) aligned exactly 1 time

1518185 (7.16%) aligned >1 times

感觉没有变化,不知道为什么?

21192819 reads; of these:

21192819 (100.00%) were unpaired; of these:

14236838 (67.18%) aligned 0 times

5437793 (25.66%) aligned exactly 1 time

1518188 (7.16%) aligned >1 times

32.82% overall alignment rate

发表这个软件的文献本身也把这个软件跟其它软件做了详尽的对比

http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n4/full/nmeth.3317.html

ProgramRun time (min)Memory usage (GB)
Run times and memory usage for HISAT and other spliced aligners to align 109 million 101-bp RNA-seq reads from a lung fibroblast data set. We used three CPU cores to run the programs on a Mac Pro with a 3.7 GHz Quad-Core Intel Xeon E5 processor and 64 GB of RAM.
HISATx122.74.3
HISATx247.74.3
HISAT26.74.3
STAR2528
STARx250.528
GSNAP291.920.2
OLego989.53.7
TopHat21,1704.3

 

参考:https://www.plob.org/2015/03/20/8980.html

http://nextgenseek.com/2015/03/hisat-a-fast-and-memory-lean-rna-seq-aligner/

原文来自:http://www.bio-info-trainee.com/731.html

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