目标序列捕获测序常见问题集锦

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所属分类:Genomics

目标序列捕获测序,是将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与基因组DNA进行杂交(固相或液相),将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序。这种新的方法与PCR方法相比,通量高,同时能节省大量的时间及成本。
目前的序列捕获系统有:NimbleGen Sequence Capture Array、Agilent SureSelect DNA Capture Array及Agilent SureSelect Target Enrichment System。 利用捕获系统得到目标序列后,可以应用Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4对目标序列进行大规模测序分析。
目标区域捕获技术与目前高通量测序技术结合能应用于外显子区域以及候选基因组区域等的重测序上,可用来发现和分析SNP位点以帮助寻找许多复杂疾病相关基因及位点。

目标捕获测序有什么样品要求?

答:(1)植物样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品,最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解,OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30 ng/l;样品总量不小于500μg,详细要求参见项目合同附件。
(2)动物样品来源应选用肌肉,血等脂肪含量少的部位。基因组完整无降解,OD值在1.8~2.0 之间;样品浓度大于30  ng/l;样品总量不小于500μg,详细要求参见项目合同附件。

目标序列捕获方法的选择?

答:目前,目标捕获测序主要有以下三种捕获方法:
(1) NimbleGen Sequence Capture array + Solexa测序。
(2) Agilent SureSelect DNA Capture Array + SOLiD/Solexa/Roche 454测序。
(3) Agilent SureSelect Target Enrichment System + Solexa/SOLiD/Roche 454测序。

其各自特点如下:

类型 芯片设计 探针 捕获环境
NimbleGen Sequence Capture Array 385K序列捕获芯片可捕获多达5Mb的基因组区域;2.1M序列捕获芯片可捕获多达30Mb的基因组区域   固相捕获
Agilent SureSelect DNA Capture Array 244K序列捕获芯片可捕获多达1287个独立的基因组区域 探针长度120bp左右 固相捕获
Agilent SureSelect Target Enrichment System 安捷伦科技公司提供eArray在线设计工具,能够设计SureSelect探针混合物 探针长度120bp左右 液相捕获(杂交发生在液体环境中)

NimbleGen芯片捕获序列的方法?

答:以外显子捕获结合Solexa测序为例。实验步骤大体如下(如图1):(1)对基因组DNA进行片段化处理;(2)对片段化的双链DNA进行末端修复;(3)将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端;(4)连接特定的测序接头DNA片段的两端;(5)纯化连接产物以除去未连接的接头序列;(6)LM-PCR的线性扩增纯化好的文库,并纯化扩增产物;(7)将检测合格的产物合格后的DNA片段与NimbleGen 2.1M Human Exome Array芯片进行杂交;(8)去除未与芯片结合的背景DNA,将经过富集的外显子区域的DNA片段洗脱下来;(9)这些DNA片段又随机连接成长DNA片段后,再次被随机打断并在其两端加上测序接头;(6)经过LM-PCR的线性扩增,在经qPCR质量检测合格后即可上机测序。

NimbleGen外显子捕获流程图

Agilent SureSelect序列捕获系统的方法?

答:Agilent SureSelect序列捕获有固相捕获(芯片)和液相捕获两种,固相捕获(芯片)其基本方法同NimbleGen芯片捕获方法,在此我们主要以Agilent SureSelect Target Enrichment System 液相捕获系统结合Solexa测序进行说明,其主要流程如下(图1):(1)对基因组DNA进行片段化处理;(2)对片段化的双链DNA进行末端修复;(3)将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端;(4)连接特定的测序接头DNA片段的两端;(5)纯化连接产物以除去未连接的接头序列;(6)PCR扩增连有接头的片段DNA并纯化;(7)样品文库检测;(8)样本文库、SureSelect capture library在杂交缓冲液中进行杂交;(9)Dynal磁珠捕获杂交的目的DNA片段并分离纯化,除去未结合的DNA片段并消化RNA;(10) PCR扩增捕获的DNA片段并纯化PCR产物;(11)捕获得到的样本文库检测。

Agilent SureSelect芯片序列捕获流程图

在捕获过程中,影响捕获的特异性的因素?

答:捕获的特异性受各种因素影响,如捕获探针的设计不佳,捕获条件不理想,基因组DNA中重复序列的封闭不充分及基因组DNA与捕获探针的比例不合适等因素都会影响捕获 的特异性。

目标捕获测序和基因组重测序有什么不同?

答:目标捕获测序和基因组重测序在数据分析方面有很多的相似之处,它们用的算法和软件都可以相互通用,分析的步骤也大同小异。目标捕获测序可以对基因组的特定区域进行测序,例如外显子区域,而基因组重测序是对全部基因组进行测序,没有经过筛选的过程。简单看来,目标捕获测序只是基因组目标区域的重测序,获得的信息要比全基因组重测序要少。目标捕获测序只是对基因组目标区域进行重测序,测序量要低,这就允许更多的样品同时进行测序,降低成本,而且这些区域都是人们关心的区域,得到信息更加集中有用。但是,这对目标捕获测序的测序前处理提出了更高的要求,研究人员能否把握关键区段成了目标捕获测序能否获得最大成功的瓶颈。

 

 

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