DNA甲基化测序问题集锦

DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式,能在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表观。 DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记,胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用,目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以进行大规模DNA甲基化测序分析,由于Illumina Solexa GA IIx测序仪具有数据读取量大、成本低等优势, Illumina Solexa GA IIx测序仪在DNA甲基化测序方面得到广泛应用。
DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系,可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA甲基化谱式绘制,并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。

甲基化测序对样品有什么要求?

答:(1) 请提供浓度≥10 ng/μg、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品;若单次富集的DNA量不够,建议将2~3次免疫沉淀的DNA合并在一起。
(2) 样品请置于1.5 ml管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中,再将50 ml管放在封口袋中。为了防止低浓度样品黏附在离心管壁上,请使用non-stick tube运输DNA ;建议使用冰袋运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。

MeDIP富集DNA片段的流程?

答:甲基化DNA免疫沉淀法(Methylated DNA immunoprecipitation,MeDIP)是一种高效富集甲基化DNA的方法。主要通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中,从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀,形成富集。其流程如下(图1):
(1)将基因组DNA超声打断成400-500bp片段;
(2)加热变性,使双链DNA片段解链形成单链DNA样品;
(3)向变性后的单链DNA样品中加入5’-甲基胞嘧啶抗体;
(4)使用亲和层析分离(3)步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物,样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。纯化得到甲基化DNA片段(MeDNA)。

DNA甲基化测序问题集锦

甲基化测序文库构建方法?

答:通过使用5’-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段,并结合Solexa高通量测序平台进行甲基化测序,首先需要对所富集的DNA片段进行前处理,构建测序文库。其方法如下:(1)对富集的双链DNA进行末端修复;(2)将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端;(3)使用特定的测序接头连接DNA片段两端;(4)纯化连接产物;(5)高保真聚合酶PCR扩增连上接头的DNA片段;(6)检测测序文库。

MeDIP-seq比其他的甲基化研究方法有什么优势?

  答:灵活度高:能够直接对任意物种的高甲基化片段进行测序,无需已知的基因组序列信息;检测范围广:覆盖整个基因组范围的甲基化区域;精确度高:能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位;数字化信号:直接对甲基化片段进行测序和定量,不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。各种方法的优缺点如下:

方法 目前主要用途 优点 缺点
MeDIP-seq 整体基因组或特定位点甲基化检测 高通量,无需序列信息,可同时检测整个基因组和特定位点的甲基化 数据量大,需要大量的生物信息分析工作。
甲基化敏感的限制性指纹技术(MSPF) 甲基化片段筛选 可检测全基因组所有CpG岛 少量样本间的比较
限制性标记基因组扫描(RLGS) 寻找差异甲基化位点 可检测全基因组CpG岛 需使用同位素,异常结果不易解释
甲基化间区位点扩增(AIMS) 印迹基因鉴定和差异甲基化片段筛选 可鉴定印迹基因,检测全基因组CpG岛 基因组CpG位点的覆盖率有限
CpG岛扩增结合代表性差异分析技术(MCA-RDA) 分离不同样本间差异甲基化片段 可分离不同样本间差异甲基化片段 不能同时比较多个样本,不能分离出差异的低甲基化片段
亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法(Bisulfite sequencing) 特定位点甲基化水平检测 可精确检测每个CpG位点的甲基化状态 需要大量的克隆测序,过程较为繁琐且昂贵。
甲基化寡核苷酸芯片法(MSO) 特定位点甲基化检测 高通量 只能检测已知序列
染色质免疫共沉淀和芯片结合技术(CHIP-on-Chip) 整体基因组或特定位点甲基化检测 高通量,可同时检测整个基因组和特定位点的甲基化 价格昂贵
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 特定位点甲基化检测 高通量 价格昂贵,主要用于特定位点检测

 哪些因素会影响甲基化测序结果的质量?

答:由于进行DNA甲基化测序前,需要对样品进行DNA免疫沉淀富集,富集过程中反应条件是否合适,直接影响到富集甲基化DNA的量,另外还需要保证处理过程中测序样品无污染,否则会严重影响测序结果的质量;DNA免疫沉淀富集后,如果DNA的量过少,需要进行PCR扩增,PCR过程会产生偏差,影响样本甲基化结果的分析。

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目前评论:2   其中:访客  1   博主  1

  1. princjie 0

    想向版主咨询一下关于BS-seq的数据分析方面的经验和成熟好用的软件。
    请多指教!谢谢!

    • ybzhao

      @princjie 不好意思,目前我还没有具体做过Bisulfite sequencing方面的课题。但是BS-seq的数据分析有很多过程,如前期的reads mapping,这一过程又会有好多软件可以用如bwa,soap等等。