测序中加入Phix的作用

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所属分类:Genomics

测序建库的时候,会加入一定比例的Phix,那么Phix文库有什么作用呢,我转了两篇文章,方便大家理解。Phix文库最主要的目的1)是调节碱基平衡,改善测序仪的空间校正,便于后期提高base calling的准确性,2)由于Phix序列已知基因组较小,在测序的过程中Illumina的测序仪就开始将测的read与phix基因组进行比较,预估测序指标。我也遇到过,Illumina工程师在维护测序仪时,用Phix文库测试。转载内容详见下文

转自Illumina公司

PhiX对照品v3是一款可靠、连接接头的文库,适合用作Illumina测序运行的对照品。该文库来源于已妥善分析特征的小型PhiX基因组,并具备多项测序和比对优点。

通用型PhiX对照品v3不仅能用作即用型文库,还可用于多种应用,以增加工作流程价值及提高结果的可信度。

PhiX文库提供适用于簇生成、测序和比对的质量对照品,以及适用于串扰矩阵生成、定相和预定相的校正对照品。可快速对其进行比对以预估相关边合成边测序(SBS)指标,比如定相和错误率

视乎应用,PhiX对照品v3还可用作:

 

  • 适用于碱基不均衡样本(AT或GC内容低于40%或高于60%的基因组)的高浓度外标对照品
  • 低浓度掺入,适用于比对和定量效率的计算
  • 可在多样性较低样本旁的设置照品通道
  • 适用于簇生成问题故障诊断,便于确定错误是否与文库制备有关

 

转自Mars-Zhan老师

测定混合微生物群的16S的若干个片段,从其可变区的序列来进行菌落组成分序,已是很常用的实验方法。

自从MiSeq测序平台推出PE300的测序方式之后,用PE300来测16S的V1、V2、V3区,已成了最常用的菌落分析手段。

但是每次我提醒用户:在做16S文库测序的上机时,建议加入70%的PhiX文库。用户都会感到不解:为什么要浪费这70%的测序通量?

这还要从Illumina公司的测序原理说起:

Illumina的测序根本原理是用4种颜色荧光基团标记4种dNTP。

在显微扫描镜下,通过对4种颜色的荧光进行分别扫描,得到4张照片,每张照片对应于一种颜色的荧光。

把4张照片进行对比,把各张照片上的光点重合,计算每个光点的光的颜色强度,倒过来推算出这个点是哪种荧光基团,进尔再推算出这个点是哪种碱基。

MiSeq测16S文库时,为什么要加PhiX?

但请注意,因为这4张照片都是纳米级的分辨率,而测序过程中芯片是移动的,所以每次拍照多少存在一定程度的空间偏差,如上图所示。这就需要进行空间校正。

文库复杂度不够高带来的影响:

如果是文库的复杂度足够高,也就是在一个测序循环中,A/C/G/T四种碱基的比例较接近于各25%,那么4张照片上都会有足够多的明亮的光点,可供空间校正之用。

但是如果文库的复杂度不够高,典型的例子就是PCR扩增产物,比如说第一个循环,99%的 碱基都是A,那么C/G/T三种碱基加起来也只有1%。这就导致C/G/T这三张照片都很暗,上面没有足够多的光点可供测序仪来分辨,更难于做空间校正。 测序仪就会把大多数无法准确分辨的点给舍弃。

最终的结果就是:测序得到的有效数据量(PF data,Pass Filter data)很少,而且数据的质量(Q值)也偏低。

上述的原因,让Illumina的MiSeq和HiSeq 2000/2500在测复杂度低的文库(PCR扩增文库、Bisulfite处理的甲基化文库、简化基因组文库等)时,如果没有加入弥补的方法,软件就不 能很好识别的光点,导致最后的有效数据量减少、测序数据质量也偏低。

目前的解决方案是:

在测低复杂度的文库时,掺入一定量的高复杂度文库。最常用的掺入文库是Illumina出品的PhiX文库,也有些实验室会用哺乳类动物的基因组文库来增加文库的复杂度,效果是一样的。

PhiX文库有以下的特点

PhiX文库中GC含量约为45%,是碱基比例较为平衡的样本。

PhiX DNA就是ΦX174噬菌体的DNA,其基因组的长度是4kb略多,其序列已清楚地被测定。

PhiX DNA文库没有Index,所以在样本Demultiplex的过程中,被挪到undetermined的文件中,不会与别的有Index的文库相混。

PhiX的序列是已知的,所以,在测序过程中,仪器会对PhiX的序列进行比对,算出Phasing和Pre-Phasing(一个簇中,有多少比例的DNA是少合成了一个碱基(Phasing),又有多少比例的DNA是多合成了一个碱基(Pre-Phasing))

转自陈云地老师

常见的碱基组成不平衡的样本类型比如:甲基化、扩增子、转录组、ChIP、重复序列测序(16S rDNA, HLA…)等等,其中重亚硫酸盐处理后的甲基化样本是碱基组成极度不平衡的,基本没有C,只有A、T、G三种碱基,而T的含量又比正常样本增加几乎一倍。

碱基不平衡的样本可以与碱基平衡的样本混合以改善平衡程度,常见碱基平衡的样本比如人全基因组、人外显子组、Illumina标准品文库PhiX等。

平衡与不平衡样本的混合比例,根据样本的不平衡的严重程度调整。样本的碱基越不平衡,Phix文库的比例越高。

其中PhiX可以同时起到两个作用:改善碱基平衡度,作为阳性对照监控测序操作是否成功

http://blog.sina.com.cn/s/blog_751bd9440102vruh.html

http://garification.blog.163.com/blog/static/1741330252015726502943/

https://www.illumina.com.cn/products/by-type/sequencing-kits/cluster-gen-sequencing-reagents/phix-control-v3.html

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