小分子 microRNA 及其生物学特征

  • A+
所属分类:ncRNA

        王春梅,李庆章

       反义RNA技术作为一种阻断或封闭特定基因表达的手段,已经被广泛地研究与应用。目 前,双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)介导的RNA干扰(RNA interfering ,RNAi)又成为研 究的热点。在多种生物中,外源双链RNA导入细胞中,与dsRNA同源的mRNA会被降解,导致转 录后基因沉默(post transcriptional gene silencing ,PTGS)。与此同时,研究发现在生物基因组中 广泛存在一类非编码蛋白的RNA基因,其转录物在某种机制下被加工成长度大约20~24个核 苷酸的小RNA,它们被命名为microRNA (miRNA)。其表达具有组织和时期特异性,而且其中 一些基因在进化上有很高的保守性。这类新发现的RNA具有调节其他基因表达的活性,在生 物发育过程中发挥着重要的作用。在短短的几年里,已发现大约2000多个这样的基因[1]。2002 年美国《科学》杂志评出的年度十大科技突破中,miRNA的发现名列榜首。这是RNA研究的 又一个突破,被称为RNA的第二次革命,也同时为人们提供了一种全新的角度来认识基因及 其表达调节的本质。

 

1.microRNA分子的发现
 
         早在1993年Lee等[2]利用遗传分析的方法已经在线虫中发现一个22nt的小分子非编码 RNA:lin-4。发现该基因具有以下特点:长度较小,不编码任何蛋白质,转录成具有发夹结构的前 体RNA,前体RNA在某种机制下被加工成长度约20个核苷酸的RNA[2]。进一步研究表明,该 RNA是线虫异时发育时钟途径(heterochronic developmental  timing  pathway) 蛋白质 (LIN-14  ,LIN-28)mRNA 的 反义翻译抑制物 (antisense translational repressor)[3~4]。它可以和mRNA的3′端UTR序列互补而抑制其翻译。在正常情况 下它们编码的蛋白质在幼虫期是被lin-4基因产物抑制的。由于lin-4 基因突变,抑制作用丧失,突变体就不能正常发育。
         基因lin-4  被发现后,并未引起研究者太多的注意,因为尚未在其他生物中找到类似的 RNA。直至2000年Reinhart等[5]发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA:let-7。 由于两者卓越的时序调节功能,被命名为小时序RNA(small temporal RNA, stRNA)。随后,在 人、鼠及植物等物种中相继发现了它们的存在[14],2001年世界不同国家的3个研究小组在线虫(Celegans)、果蝇(Dmelanog aster )和人体中发现了近百个这样的基因,于是国际统一将这类小RNA命名为microRNA(miRNA),miRNA的研究也成为新的热点。随着miRNA家族成 员的不断 增多 , 全球成立了 miRNA 文库 , 对新 的 miRNA 进行登记 和命名直至目前,已有3518种物种的miRNA登记注册。
 
2.miRNA的特点
 
miRNA有3个明显特征:①广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它 本身不具有开放阅读框架(ORF);②通常的长度为20~24nt,但在3′端可以有1~2个碱基的长 度变化(对miRNA 的具体长度范围尚无统一标准,在拟南芥和烟草中发现26ntRNA,和在四膜 虫(Tet rahymenas )中发现的能使核部分DNA失活的28ntRNA也被归于其中[9] ) ③成熟的 miRNA,5′端有一磷酸基团,3′端为羟基,这一点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段 区别开来[7~10]。除此之外,多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。
miRNA存在于基因组的内含子、外显子或调控序列中。miRNA基因不是随机排列的,其 中有一些是成簇(cluster)存在,而且簇生排列的基因常常协同表达[7~9]。最典型的是一组高度 相关的miRNA基因(mir35~mir41) 集中簇生在C.elegans 2 号染色体的 1kb片段上,并从同一 个前体上加工形成 7 个成熟的miRNA[9]。
细胞特异性和组织特异性是miRNA表达的主要特点。实验显示,在组织培养的S2细胞(即 Schneider-2 细胞 , 从发育 20 ~ 24h 的果蝇胚胎中分离得到 ) 可发现 miR-12 等 , 却无 法找到 miR-3~miR-6[8]。与其类似,miR-171 (也有文献称之为miR239) 在拟南芥的花序和花组织中 高水平表达,而在茎、叶组织中却没有表达的迹象[11]。 虽然被miR-171 (miR239)调控的基因 在其他组织中也都存在,但仅在花序组织中大量表达,这就使人怀疑miRNA的表达和分布是 否决定了组织和细胞的特异性。而另一部分miRNA在不同细胞、组织和物种间的表达,可能 意味着它们在基因表达调控等方面具有更为广泛和普遍的作用。
目前,大多数已发现的miRNA的表达都具有时序性。mir3~mir7基因只在果蝇早期胚胎 形成时表达,而miR-1、miR-8和miR-12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升并在成虫期维持在较 高水平。与此同时,在所有阶段都存在的miR-9和miR-11的含量却急剧减少[8]。基因表达的严 格或不严格时序性;表达水平的显著变化,以及所在组织和细胞的特异性,都暗示miRNA可能 参与了深远而复杂的基因表达调控,并决定发育和行为等的变化[12]。Sempere等人[13]通过 Northern杂交的方法对已知的119个miRNA基因的表达做了检测,发现有一些是在特异的组织 表达,有一些在不同组织只是表达量不同样,而在脑组织表达的miRNA的作用方式表明这些 miRNA与脑神经元的分化相关。目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程,如 发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应脂肪代谢等,越来越多的证据表明miRNA在细 胞中起着调控基因表达的重要作用,RNA在基因表达调控中的作用越来越受到人们的重视。
 
3.miRNA的形成
 
        miRNA是由机体内源基因转录的约60~70nt的发夹结构前体(Pre-miRNA)被Dicer酶切割后产生的约20~22nt长度非编码单链核苷酸片段,其可以使特异基因在翻译水平抑制。
 

3.1 miRNA  的成熟

        在哺乳动物 细胞内 miRNA 的成熟 : 首先 , 基因组内 作为长转录 本表达的单 一或一簇 miRNAs由polⅡ被加工成60~70nt的miRNA前体(pri-miRNA)[18-20],在核经Drosha加工成为 pre-miRNA,然后pre-miRNA运送到胞浆被Dicer酶或在胞核被CAF(Dicer酶的同族物)加工成 成熟的20~24nt miRNA[15-17](图1)。

图1 miRNA的加工成熟过程

3.2 miRNA的效应

 

        成熟的miRNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex ,RISC) [21], 近来的研究发现miRNA形成复合体后作用于靶基因[22]。
 
        miRNA介导的RISC作用于靶点mRNA通过对mRNA剪切或抑制翻译过程而调节基因的 表达。目前有关miRNA及其靶mRNA之间的作用机制尚不清晰。在人类,成熟的miRNA已被 发现与Gemin3;Gemin4;EIF-C2等形成15S的核糖核蛋白体RNP复合物(也称RISC)[23]。 miRNP不仅能通过经典的miRNA 途径作用于特异基因 mRNA的3′非翻译区(3′-UTR), 抑制 mRNA的翻译而不影响mRNA的稳定性,也能RISC样降解与之完全互补的靶RNA。近有报道 表明miRNA也作用于5′-UTR区,需要指出的是miRNA与3′-UTR和5′-UTR的结合是不完全互 补的,但具体的机制仍不明确[24]。
 
 

4 miRNA的靶基因和功能

         虽然现在已经找到了1000个以上miRNA,并提出它们在细胞增殖、分化、代谢与死亡中 发挥着重要的调节作用,但是至今为止,真正确认功能的miRNA还是微乎其微。Lin-4、Let-7 的靶基因是ras信号通路的蛋白[25-27];Lin-41、hbl-1、Lin-14 和lin-28调控时序发育[28];而 miR-196在哺乳动物细胞中的靶基因为HOXB8调控脊椎动物发育[29,30];miR-375在哺乳动物 中的靶基因为Mtpn对胰岛素分泌进行调节[31];miR-14的靶基因功能未知可能调控果蝇的凋 亡和脂类代谢[32];miR-181在哺乳动物的靶基因功能未知可能是调节造血系统的分化[33]; Bantam 在果蝇中靶点为Hid前凋亡基因,在发育中调节细胞增殖与凋亡[34,35]。

 

图2 miRNAs作用的靶细胞

Figure 2 Roles of miR-375 and miR-143

        虽然在不同的时空发育阶段,它们的表达量不同,但是多种miRNA在同一个细胞中的表 达使得细胞处在一种内在的miRNA环境中,这个环境控制着成千上万的编码基因的mRNA水 平,使得各种蛋白的表达处在一个适度水平。Bartel等人[36]将这些miRNA比作微型电阻,根据 miRNA与靶基因互补的程度,执行从切割(100%抑制)到微弱抑制的不同的抑制作用。lin-4作 用于lin14和lin28,let-7作用于lin41和hbl-1起着明显的表型改变作用,在miRNA家族中是为数 较少的,更多的则是起着微调的作用。miR-7和miR-14有着多个靶基因,它们从一个整体上起 着介导某一功能的作用。由于有多个靶点,有些miRNA会有大量表达,比如miR-2在一个细胞 内有约50000个拷贝,这远多于普通mRNA的表达量。Lee等人[37]研究了通过导入某些miRNA 能够导致上 百个基因 mRNA 水平 的下 调, 虽然并不 能完全肯定 所有的这些 下调基因是 由 miRNA直接导致,但这给出了直接证据证明一个miRNA可以调控多个靶基因。另一些则是多 个miRNA作用于一个靶基因上,而最近开发的同时检测所有miRNA的表达图谱的技术[38],使 研究者能更方便地从整体上掌握特定的时空阶段miRNA产生的生物学效应。miRNA这种转 录后微调的优点如下:①比从蛋白水平的调节更节省能量;②相对于转录调节,miRNA的效果 更快而且是可逆的;③对于一些只需微量蛋白改变的现象,只有通过miRNA来达到。比如对 某种蛋白来说,1~2个mRNA拷贝就足以过量表达,这时就需要miRNA来调节控制蛋白的水 平;④内含子中编码的miRNA是一种细胞内资源的高效利用。就像前面提到的一样,miRNA 主要通过抑制它的靶基因来起调控作用,至今为止没有发现有上调能力的miRNA。

       miRNA的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡过程。Lewis等人[39]的预测 结果发现,miRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然miRNA的作 用也是特异的,特别是5′端的2~8个碱基,特异性的靶向与它的靶基因,但是与siRNA不同的是 miRNA的特异性并不那么强,在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶基因,如lin-4 作用于 lin14和lin28[40], let-7作用于lin41和Hbl-1[40],这就是人们提出的“多个靶点”的假说。人们也提 出可能多个miRNA调控一个靶基因[40,41]。因此,miRNA的调控作用很可能是一种调控网络, 它需要接受某些信号的刺激,从整体上调控有机体的生命活动。

      目前miRNA 的研究现在还处在理论水平上, 讨论关于miRNA 的应用还为时过早。但 miRNA作为体内正常表达的基因,与生命活动的关系,还有待进一步研究。以miRNA为靶点 研究生命活动或者以miRNA为治疗手段的设想[43],以后可能会成为焦点。而Calin等人[43]报道的miRNA基因芯片技术也很可能成为肿瘤诊断的工具。Suh等人[44]报道,在人胚胎干细胞中表达的miRNA与其他细胞类型的miRNA有很大的不同,miRNA作为人器官定向分化的调节 子,为以后人器官体外培植带来促进作用。miRNA作用和功能的揭示必定给miRNA带来广阔 应用的前景。

 

5 展望

       自从在四膜虫中发现核酶以来,引起了整个生物学界对RNA及其作用的关注,也让人们 就生命起源的问题争论了十几年。在人们对生命由RNA起源的争论降温时,1998年Fire等人报 道在线虫中发现了RNAi,重新又将人们的视线转到RNA上来。RNAi是一个强大而特异的基 因沉默机制,可成为研究基因功能[44]和疾病治疗[45]的有用工具,这是生物研究领域的一个突 破性研究成果。miRNA研究的飞速发展也得益于RNAi的发现。但与此不同的是,miRNA是生 物体内源的小RNA分子,研究表明它们在生物体内不仅仅是代谢产物,而且还是机体有目的 编码的重要的调控分子。它们参与生物体的生长、发育、衰老、死亡的调控。随着研究的深 入,miRNA 将在生命起源和物种进化、基因表达调控的复杂性、疾病发生和发展的机制等方 面起到更为深远的作用。同时,miRNA的研究亦将为RNAi技术的应用提供新的依据、思路和 空间。现在,欧美等发达国家已将有关miRNA的研究广泛而深入地运用到组织器官的定向发 育、细胞生长分化的时空调节、信号通路的开启和关闭、细胞周期的监测与调控、学习与记 忆、肿瘤的逆分化、肥胖、衰老和死亡,疾病的防治以及有目的的基因表达调控上。

        寻找调控的miRNA基因以及miRNA的靶基因,揭示miRNA具体的作用机制是非常重要 的。就目前的研究来看,虽然在各个物种中发现的miRNA数量不少,但是能给出直接证据证明 miRNA的靶基因及其功能的miRNA很少,而且多数是通过筛选突变子获得的,这说明现在寻 找miRNA基因的研究与其功能的研究是脱节的,现在摆在科学家们面前的两大问题是:在各 种生物中找齐这些miRNA和发现它们的靶基因并揭示它们的功能,这也可以说是后基因组时 代需要解决的问题之一[46]。由于miRNA 基因对于生物的生长、发育和分化非常重要,而且具 有特异的时空表达的特点,那么全部miRNA基因及其功能的揭示可能将会给人们对生命现象 的认识带来一场新的革命。

参考文献

 

[1]Yong Kong ,MicroRNA: Biological and Computational Perspective Geno. Prot. Bioinfo. 2005, 3 ( 2):62~72 [2] Lee R C ,Feinbaum R L ,Ambros V. The C. elegans heterochronic gene li n - 4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 RNA. Cell ,1993 ,75 :843~854.

[3]Wightman B , Ha I , Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin - 4 by lin - 4 mediates temporal pattern formation in C. elegans . Cell ,1993 ,75 :855~862.

[4 ] Moss E G,Lee R C ,Ambros V. The cold shock domain protein L IN - 28 controls developmental timing in C. elegans and is regu-lated by lin - 4 RNA. Cell ,1997 ,88 :637~646.

[5] Reinhart B J , Slack F J , Basson M , et al . The   nucleotide let-7 RNA regulates evelopmental timing in Caenorhabditis elegans .Nature , 2000 , 403 (6772) : 901~906

 

[6] Baulcombe D. DNA events : an RNA microcosm. Science , 2002 ,297 (5589) : 2002~2003

[7] Ruvkun G. Molecular biology glimpses of a tiny RNA world.Science , 2001 , 294 (5543) :797~799

[8] Lagos-Quintata M , Rauhut R , Lendeckel W, et al . Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science , 2001 ,294 (5543) : 853~858

[9] Lau N C , Lim L P , Weinstein E G, et al . An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in

Caenorhabditis elegans. Science , 2001 , 294 (5543) : 858~862

[10] Lee R C , Ambro V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science , 2001 , 294 (5543) : 862~864

[11] Reinhart B J , Weinstein E G, Rhoades M W, et al . MicroRNAs in plants. Genes & Dev , 2002 , 16 (13) :1616~1626

[12] McManus M T , Sharp P A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics , 2002 , 3 (10) : 737~747

[13] Sempere L F, Freemantle S, Pitha-Rowe I, et al. Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation. Genome Biol, 2004, 5(3): R13

[14]. Pasquinelli, A.E., et al. Conservation of the se-quence and temporal expression of let-7 heterochronicregulatory RNA. Nature2000. 408: 86-89.

[15.] Zeng, Y., et al. Recognition and cleavage of pri-mary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha. Embo J. 2005. 24: 138-148.

[16] Zeng, Y. and Cullen, B.R.. Structural require-ments for pre-microRNA binding and nuclear export by Exportin 5. Nucleic Acids Res. 2004 32: 4776-4785.

[17]. Park, M.Y., et al.. Nuclear processing and ex-port of microRNAs in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005102: 3691-3696.

[18] Kim, V.N. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. 6:376-385.

[19] Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. Embo J. 2004. 23: 4051-4060. [20]. Cai, X., et al.. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated ranscripts that can also function as mRNAs. RNA    200410: 1957-1966.

[21]. Okamura, K., et al. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage path-ways. Genes Dev. 2004. 18: 1655-1666.

[22] Tang, G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. Trends Biochem. Sci. 2005.    30: 06-114.

[23] Zeng Y, Cullen B R. Structural requirements for pre-microRNAbinding and nuclear export by Exportin 5. Nucleic Acids Res,2004, 32(16): 4776~4785

[24]Hutvágner G, Zamore P D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 2002, 297: 2056~2060

[25] David P B. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, 116: 281~297

[26] Bartel D P, Chen C Z. Micromanagers of gene expression: The potentially widespread influence of metazoan microRNAs. Nat Rev Genet, 2004, 5(5): 396~400

[27] He L, Hannon G J. MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genet, 2004, 5(7): 522~531

[28] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Meyer J, et al. New microRNAs from mouse and human. RNA, 2003, 9:175~179

[29] Mansfield J H, Harfe B D, Nissen R, et al. MicroRNA-responsive ‘sensor’ transgenes uncover Hox-like and other developmentally regulated patterns of vertebrate microRNA expression. Nat Genet,2004, 36(10): 1079~83.

[30] Yekta S, Shih I H, Bartel D P. MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science, 2004, 304(5670):594~596

[31] Poy M N, Eliasson L, Krutzfeldt J, et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature, 2004,432: 226~230

[32]Xu P, Vernooy S Y, Guo M, et al. The Drosophila microRNA mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.Curr Biol, 2003, 13: 790~795

[33] Chen C Z, Li L, Lodish H F, et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science, 2004,303: 83~86

[34] Hipfner D R, Weigmann K, Cohen S M. The bantam gene regulates Drosophila growth. Genetics, 2002, 161:1527~1537

[35] Brennecke J, Hipfner D R, Stark A, et al. bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell, 2003,113: 25~36

[36] Bartel D P, Chen C Z. Micromanagers of gene expression: The potentially widespread influence of metazoan microRNAs. Nat Rev Genet, 2004, 5(5): 396~400

[37] Lim L P, Lau N C, Garrett-Engele P, et al. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature, 2005, 433: 769~773

[38] Nelson P T, Baldwin D A, Scearce L M, et al. Microarray-based,high-throughput gene expression profiling of microRNAs. NatMethods, 2004, 1: 155~161

[39] Lewis B P, Shih I, Jones-Rhoades M W, et al. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell, 2003, 115:787~798

[40] Reinhart B J, Slack F J, Basson M, et al. The 21 nucleotide let-7RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.Nature, 2000, 403: 901~906

[41] Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature, 2004,431(7006): 350~355

[42] Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res, 2004,

[43] Calin G A, Liu C G, Sevignani C, et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(32): 11755~11760

[44] Suh M R, Lee Y, Kim J Y, et al. Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs. Dev Biol,

2004, 270(2):488~498

[45] 徐颖,  朱成钢,  金勇丰, 等. dsRNA  对家蚕核多角体病毒(BmNPV)复制的抑制作用.  科学通报, 2004,49(11): 1073~1078

[46]陈 芳 殷勤伟 调控基因表达的miRNA 科学通报 第50 卷 第13  期 2005  年7 

 

avatar

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: