单细胞测序教程

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所属分类:Genomics

小伙伴们,大家好,今天我们来开启一个新的话题,Single cell sequence,近来单细胞测序在探索生物过程、疾病机理等方面展现了前所未有的精度,通过对单细胞进行 DNA 和 RNAseq 我们得以高精度的了解单个细胞水平的体细胞突变情况,并且对于一个样本中细胞类型的组成和解析获得空前的认识。

那么,我们如何开展单细胞测序?单细胞测序的原理是怎样的那?我们如何开展单细胞测序? 单细胞测序的数据处理与一般的 RNA-seq、DNA-seq 有何不同?

  • 第一讲

好的,言归正传,首先我们来看看如何获得单细胞,从而进行下一步的测序过程。

单细胞测序教程

为了进行单细胞测序实验,首先我们需要分离出感兴趣的单细胞,比较常用的方法之一是使用流式细胞仪(FACS)方法进行分离,我们可以使用无限制的分选技术,从而可以获得随机样品,同时也可以选择散射性质等设置 sorting gate。不仅如此,我们还可以使用荧光标记的抗体获得细胞表面特异 marker 的细胞亚群,从而探究这一 sub group 细胞的特性。

目前的技术允许同时检测多达 20 个参数,因此可以将单细胞分选到 96 或 384 孔板中进行接下来的单细胞测序。但是 FACS 也有缺点,首先需要较大的起始细胞量,同时可能导致有些孔中有两个,有些孔中没有细胞。

显微操作技术提供了获得少量细胞的替代方法,我们可以通过直接特定位置摘取单个细胞进行测序。但是这种方法依赖于人工操作,无法实现高通量进行。

最近,微流控技术在单细胞分选上展现良好的应用,微流控技术可以对整个过程进行良好的监控和处理。微流控的缺点主要在于固定的微流控芯片等。

大家可以通过观察上图来看到每种方法的优缺点。

在获得单细胞之后,对于 single cell DNA-seq,我们该如何开展下面的实验那?

在多细胞生物体中,由于细胞存在着有丝分裂,在传代过程中 DNA 复制存在着各种各样的突变,这些突变通过积累最终可以导致癌症等多种疾病的方法,在生殖细胞发育过程中,也可以看到不同种基因组突变,包括替换、插入和删除、拷贝数变异、染色体结构重组等。这些过程,我们可以通过 single cell DNA-Seq 来了解,但是对于一个细胞而言,一个哺乳动物细胞,通常的 DNA 只有不到 10 pg,因此我们首先需要对全基因组进行扩增才能进行下一步的实验。

目前的全基因组扩增技术(WGA)主要是通过 PCR、多重替换扩增技术(MDA)或两者的组 合来实现。

PCR 策略主要是通过使用随机引物进行扩增,然后引入通用 adaptor。

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MDA 方法则利用具有链置换活性的 DNA 聚合酶,∅29 进行恒温扩增,这是一种滚环复制酶, 可以处理长达 10 Kb 的序列,一旦接触到前面结合的序列后,聚合酶可以释放前者 DNA,从而释放用于进一步的扩增。对于这两种方法,随机引物 PCR 方法实验更高水平的一致扩增, 但是覆盖度较低。MDA 方法由于 DNA 聚合酶的高保真性和高处理特性,可以实现较好的覆盖度也有利于 SNP 等精细实验,然而由于 GC 含量等影响,MDA 可能导致不一致扩增,Gcbias 比较大。因此 MDA 用于 CNV 检测等的假阳性概率比较大。华人科学家谢晓亮等人基于前两种方法提出综合两种方法的 MALBAC 方法,实现了高覆盖度的一致性扩增方法。

通过增加互补末端引物使用滚换复制酶产生可以末端配对的 loop,被扩增出来的 DNA,由于末端配对,因此无法被称为接下来的模板,从而可以实现近乎线性的扩增,经过五轮线性扩增后,然后通过 PCR 进行指数级扩增,相对于 MDA 方法 31%-61% 的丢失率,MALBAC 方法只有 1% 的缺失覆盖率。

同时对于 SNP 和 CNV 的检测的假阳性更低。

其他的方法用于减少扩增时的不一致性则主要是通过减少反应体系,通过使用 nano-liter 级别的反应体系,增加有效的模板浓度,这类技术被称为 MIDAS 技术。

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这里有一份总结各类技术主要是使用方法的表格,方便大家使用。

在获得单细胞基因组测序之后,首先我们需要监控 read 的质量剔除低质量的 reads,然后进行基因组的 map 工作等,通过矫正由于 GC 含量引起的误差之后,我们可以多种算法 breakpoint,CNV 等。

这里向大家推荐 GATK 工具包,这个工具包包含了处理下一代测序和virant calling的线管技术。

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学会了 DNA-seq 的初级处理之后,我们如何对不同的细胞之间进行比较和聚类?进行详细的数据挖掘?我们如何进行 RNA-seq?

  • 第二讲

上一讲我们讲到了不同单细胞 DNA 测序的方法,比较了不同测序方法的异同?大家还记得吗?这里给一张图片供大家复习参考:

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今天,我们主要来了解一下单细胞 RNA-seq 的方法,使用 microarray 和 RNA-seq 我们可以获得在不同组织和细胞中基因表达的强弱,显而易见,单细胞 RNA-seq 方法为我们具体一个组织内,或者不同类型细胞的表达差异,同时还可以为我们发现新的细胞类型奠定基础,单细胞 RNA-seq 的主要障碍是如何从单个细胞中获取充分量的 RNA 用于下一步的测序,不同的方法被开发出来用于扩增低于 pg 级的 mRNA。

这些方法的主要障碍是扩增的 bias 问题,对于来自不同基因的 mRNA 之间的差异比较产生干扰。

第一个利用单细胞进行 RNA-seq 是 Surani 实验室在 2009 年开发出来的,第一作者汤富酬大神,自此 Tang 大神在 single cell 领域风生水起,这是后话,接下来人们用 single cell RNA-Seq 跟踪 MES cell 的发育分化情况,扩增的方法主要是使用将 RNA pull down 下来,然后使用 polyT 引物反转录带 ployA 的 RNA,同时引物上含有特定的 anchor 序列。

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科学家们在借鉴了基于 microarray 用于 single cell sequence 的技术后,修改了一些实验条件,比如延伸时间等,从而获得全长的 cDNA,进一步通过 SOLID 测序,我们可以看到具有非常好的稳定性。

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在这个技术之后,2011 年科学家们使用了新的 cell barcode 方法,从而可以复杂的探究多个复杂细胞的特性,称为 STRT 技术,但是 STRT 技术对于 5’end 具有偏好性,基于转座子酶,人们开发了升级版的 STRT2 技术。

为了减少由于扩增引起的误差,人们在一些单细胞测序的步骤中增加了 UMI(unique molecular identifiers),UMIs 是由 4-10 个随机核苷酸组成的序列,在 mRNA 反转录后,进入到文库中,每一个 mRNA,随机连上一个 UMI,因此可以计数不同的 UMI,最终计数 mRNA 的数量。

不同的方法的优劣我们可以在最上面的图中得到,那么我们如何进行选择哪?

如果我们想了解不同细胞间的异质性,那么我们需要减少实验的 bias,推荐使用 UMI 相应的技术,如果我们想了解 RNA 全长,包括 splice site 等信息,那么我们就需要选择包含全部转录长度的技术。

目前多种技术可以通过多通道微流控自动处理技术进行处理,可以允许自动分离和处理细胞,同时控制细胞的数量,实验的误差,我们相信随着实验技术的改进,single cell sequence 终有一日,会成为常用的实验技术,助力人类了解自己,了解生物!!

  • 第三讲

学完前两讲后,有没有对于单细胞测序有一个初步的认识那?这一讲我们主要来聊一聊如何利用单细胞 RNA-seq 数据,进行数据挖掘?

首先让我们来考虑一个非常关键性的问题,当我们如果想做单细胞测序,那么我们应该如何设计我们的实验?

说的更直白一些,我们需要测多少细胞?测多深?

单细胞 RNA-seq 为我们了解组织的组成等提供非常好的工具,而单细胞测序的效果也取决于我们到底测多少细胞,一般而言几百个细胞的单细胞测序不仅仅捕获常见的细胞成分,对于一些稀少的细胞类型也会测到,不过,需要考虑的情况是我们捕获细胞的方法是否具备一定的偏颇?比如不同类型细胞细胞的大小?细胞的形态?是否会对细胞的获取有所倾向?同时我们还需要实验产生的误差,我们需要估计我们所操作的成功率,由于 RNA 降解,细胞的凋亡等,这些数据将会被排除,我们初始选择的细胞个数往往会大于我们目标测序的细胞个数。

那么第二个问题,我们需要测多深?

如果我们使用 UMI 计数方法( UMI 计数,是指在建库过程中,通过在引物上,增加随机序列,则对于同一种 mRNA 连上同样的 UMI 概率几乎为 0,则我们可以忽略由于 PCR 造成的误差,对于一种 mRNA,测到的 UMI 数量可以近似看成 mRNA 的表达个数),推荐至少每一个转录本至少覆盖 3-4 倍,确保一些低表达的 mRNA 不会因为 noise 而被忽略,一般而言,illumina 的一条 lane 中最终可以被使用的数据大概占 50%,另一些 reads 因为实验技术所限,为一些 adaptor 等无效序列。

这里我们做一个计算题:

一个细胞假设我们最终想得到大概 10000 种转录本的信息,那么对于一个 lane 而言( nextseq 机器可以有 200million 条 reads ),那么可以测多少细胞那?200,000,000/10000/4/2=2500 大概可以测 2500 个细胞!好了,那我们假设如果我们获得了数据后,那我们该如何进行下一步的数据分析那?

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首先我们需要对测序的质量进行评估,截去低质量部分,这里推荐的工具为 Fastqc,以往的文章中,大程跟大家介绍过 fastqc,还记得不?

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这里小编推荐大家最终截取的长度需要大于 35bp,保证匹配的真实性,对质量进行评估后,我们需要进行匹配,常用的包括 BWA,bowtie 等,好了问题来了,我们选择什么作为 reference?

如果我们选择基因组作为 reference,那么一个显著的问题是可能匹配到假基因等位置,影响我们的定量评估。

使用转录组作为参考可以显著的减少比对空间,考虑到不同的剪切问题,如果我们对于不同转录本,没有要求的话,推荐大家使用多转录本 merge 的序列。注意了,注意了,注意了!!

因为大部分单细胞测序主要是富集 3‘UTR 部分,那么如果我们使用 cufflink,就会造成很大的问题,当我们比对完后,需要确定每个转录本的表达量,前面我们说到UMI用于 RNA 的计数,在计数前,我们还需要对不同的 cell 进行滤过。

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由于存在 RNA 降解等多种问题,这里我们需要考虑到去除一些低转录本等情况,同时我们还需要考虑去除低扩增效率的 cell 等。那么我们如何比较不同 cell 之间的差异那?首先需要做的便是归一化,这里跟大家介绍使用 spike-in RNA 进行归一化的方法,spike-in RNA 往往是我们在建库过程中使用的人为计数后,掺入的 RNA,可以帮助我们对不同 cell 之间的进行横向的比对,如果我们没有 spike-in 怎么办呐?也不必害怕,往往简单的将总共转录本进行计数,也是可以的。我们可以将所有的 cell 归一化到 reads 总数是中位数的细胞的 reads 总数中,或者将所有细胞归结成同样的 reads,被称为 down-sampling。

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在获得不同细胞不同基因的表达后?我们该如何从中挖掘出我们想要的信息那?首先如果我们对一个组织或者器官等进行单细胞测序,我们首先能做的便是分析其中可能的细胞亚类。

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我们可以使用主成分分析(PCA)等,对细胞群进行聚类分析,我们可以利用第一主成分,第二主成分等对细胞进行分类,如果我们想要了解精细的细胞类别,我们可以结合使用层次聚类方法。不过我们需要考虑由于 batch effect 造成的假阳性聚类问题等。另外还需要考虑由于细胞本身,比如细胞处于不同细胞周期造成的异质性,当然我们可以通过微流控技术在最开始的过程中,就减少可能存在的复制中的细胞,另外我们也可以对于 cell-cycle related 基因变化进行剔除。

聚类中,一个比较难的地方,在于如何鉴定一些稀少的细胞类型,对于一些占比重 1% 以下的细胞,该如何进行聚类那?,

近期有一个课题组通过首先使用 k-means 聚类方法寻找常见的细胞类型,进而对于 outlier 进行 screen 寻找。

这个方法(RaceID)以高敏感性寻找到了一些在肠道中稀有的细胞群落。

那么我们找到这些不同类型的细胞类型后,我们该干什么那?

一个很关键的问题,我们需要鉴定一些 marker gene,比如我们可以使用差异基因分析工具,诸如 DESeq 等来推测相关 marker 基因知道下游的分析。

大家有没有听懂那?

参考文献:

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Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X.,Bodeau, J., Tuch, B.B., Siddiqui, A., et al. (2009). mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat. Methods6, 377–382.

 

 

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