二代测序的barcode/index

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所属分类:Bioinformatics
  • 二代测序二代测序是做什么的
  • 如何选择好的barcode
  • barcode组合举例
  • 建库测序时barcode是如何发挥作用的

barcode,也叫index,在二代测序里面是用于区分不同样品的。为了避免概念扩大,在此处仅指的在二代测序(NGS)里面的barcode。

barcode是做什么的

普遍健壮的测序仪和通常瘦小的组数据

当今二代测序仪器中应用最为广泛的当属illumina公司的测序仪,以Hiseq-2000测序仪为例,其有2个流动槽(flowcell),每个flowcell有8条lane(通道),而单就其一条lane的测序数据量就可达44G。

然而对于目前的外显子组测序来说,测序区域大约64M,测序深度200X,总数据量也才13G,Hiseq-2000的一个lane就足以测定3个外显子组样品。以转录组来说,一个样品测序量不会超过4G,一个lane可以同时测定10个转录组样品。

大体而言,外显子组测序、转录组测序、miRNA测序、lncRNA测序、ChIP测序等组数据,每个样品所需的数据量通常都比较少。
测序数据的单位

核酸序列数据是以“A、T、G、C”碱基顺序表示,而其数量的大小可以使用k、M、G等单位来表示,k代表10^3^、M代表10^6^、G代表10^9^,例如,人全基因组大小为3G(或3Gb),也就是3X10^9^b。 此外,计算机的存储单位也是使用k、M、G等单位来表示的,不过计算机的存储单位的换算为1024进位,不同于碱基序列的1000进位。考虑到一个字母在计算机内存储为1Byte,因此粗略使用时,测序数据量可以近似等于其占用计算机的大小。

barcode是样品标签

由于测序仪器的测序能力远大于测试样本序列量,为避免仪器浪费,因此一个lane同时测定多个样品成为很自然的思路。然而为了区分多种样品的序列,就必须要给不同样品加上特定的“标签”,从而可以在后续数据分析时将不同样品数据分开,而这个“标签”就是barcode。

简言之,barcode就是测序中混合样品的”身份证“,用于区分不同样品。

如何选择好的barcode

barcode的选择有两个原则:碱基平衡和激光平衡。

碱基平衡

碱基平衡是指的需要兼顾barcode序列的平衡度与复杂度,平衡度是指的碱基的比例是均衡的(1:1是最均衡的),而复杂度是指的碱基的种类是多样的(四种碱基同时存在是最多样的)。

所以最好的barcode序列应该是同时有A、T、G、C四种碱基,且各碱基所占比例近似均为25%。

此处所说的碱基平衡是指的多个barcode之间的平衡,并非一个barcode内部的碱基平衡。举例来说,有12个转录组样品需要测定,那么就需要12个barcode(假定每个barcode长度为6位),根据碱基平衡原则,第一位barcode碱基应该尽量同时存在A、T、G、C四种碱基,且各碱基所占比例近似均为25%,也就是这12个barcode序列最佳情况应该是以A、T、G、C开头各3个。剩余5个碱基位的barcode以此类推。

激光平衡

在illumina测序仪中,A和C两种碱基共用一种激光,由波长660nm的红激光激发;G和T共用一种激光,由波长532 nm的绿激光激发。因此假使不能满足碱基平衡的情况下,可以退而求其次,尽量满足激光平衡。

简单来说,激光平衡就是尽量在使用的一组barcode中满足每个碱基位都是A+C=G+T。

既不满足碱基平衡,又不满足激光平衡的barcode将会有很大的数据分离隐患,或者无法分离开样品,或者无法识别某些测序片段。

barcode组合举例

illumina barcode 组合

Illumina推荐的12个barcode序列详列如下。

  1. ATCACG
  2. CGATGT
  3. TTAGGC
  4. TGACCA
  5. ACAGTG
  6. GCCAAT
  7. CAGATC
  8. ACTTGA
  9. GATCAG
  10. TAGCTT
  11. GGCTAC
  12. CTTGTA

以其中的第一个位置为例(纵列),A:G:C:T=3:3:3:3=1:1:1:1。实际上,该barcode组合每个位置的碱基比例都接近1:1(具体见下表),碱基平衡度接近完美。

位置 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th
A 3 3 4 3 3 3
T 3 3 3 3 4 3
C 3 3 3 3 2 3
G 3 3 2 3 3 3

样本数少于4种,必然无法满足碱基平衡,怎么办

如果样本数少于4种,则barcode每一个位置的碱基最多只有3种,不可能做到碱基平衡,怎么办呢?这时一定要尽量保证激光平衡,切不可在同一barcode位放置同一种荧光碱基,甚至是同一种碱基。

当然Illumina也提供了这种情况的解决方案,他们推荐的low-level pooling的barcode组合有3种,序列如下:

2重组合

#6 GCCAAT

#12 CTTGTA

3重组合

#4 TGACCA

#6 GCCAAT

#12 CTTGTA

6重组合

#2 CGATGT

#4 TGACCA

#5 ACAGTG

#6 GCCAAT

#7 CAGATC

#12 CTTGTA

这3种barcode组合包含有一个共同的内核:6号barcode和12号barcode。6号和12号组合是百分百激光平衡的,其每一个位置(纵列,即GC、CT、CT、AG、AT和TA)都分别属于不同的激光。也就是说,只要barcode组合中包含6号和12号,就能满足最基本的de-multiplexing要求,不至于数据完全失误。

除了illumina推荐的12个barcode,还有康奈尔大学的96个针对ApekⅠ酶建库的barcode,华中农业大学的96个针对MseⅠ酶和SacⅠ酶的barcode,美国科罗拉多大学博尔德分校的丹尼尔还发表了设计barcode的软件。

建库测序时barcode是如何发挥作用的

这里以illumina测序仪为例。如图所示,在最下面的构建完好的可上级测序的序列中,insert是样品片段,barcode(图中的“i")位于下游接头中。"a”与“e"是接头序列,用于结合到测序仪的flowcell上的P5和P7序列。
indexcode

若要构建完整的单barcode测序DNA簇,需要如下步骤:

  • 超声,将DNA片段打碎,然后T4酶修补末端, klenow酶在3'末尾加A。
  • DNA连接酶将测序引物b-c以及d-c’与测序片段(末端加T)连接,其中”d"包含barcode序列“i”。
  • 将文库片段上机,进行桥式PCR扩增,完成最终测序DNA簇构建。

图中,c与c'互补,d与d'互补,i与i'互补。

在illumina实际测序时,读完Read 1(在图中是以a-b-c方向延伸的序列)之后,如果需要继续读取barcode序列,那么就将Read 1变性洗走,然后加入barcode引物(也就是c-d'),继续第二轮读取,一般读取6-8个碱基,这6-8个碱基就包含了barcode序列。

 

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