以RNA为测序模板的新技术:FRT-seq

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所属分类:Bioinformatics

目前发展成熟而被应用在许多研究的第二代测序技术中,被测序的library 大多为DNA而非RNA(测序原理请参照本部落格先前文章),在现有的mRNA-seq技术中,需先将RNA反转录为DNA,制备出DNA型态的library后,始能执行测序反应。针对mRNA-seq,近日Lira Mamanova团队以Illumina测序平台为基础,发展出可直接以RNA library做为测序材料的新技术,名为FRT-seq(Flowcell Reverse Transcription sequencing),此技术将RNA library注入flowcell内,并且直接在flowcell内执行反转录及bridge PCR,FRT-seq能完整保留RNA正负股的信息(即strand-specific mRNA sequencing),除此之外,其制备library过程中不需经由PCR的放大,所以可以减少PCR所产生的错误。

FRT-seq library的制备过程中,首先将mRNA纯化出来并且打断,再将RNA的3'及5'端分别接上两段特殊设计且不同序列的adapter,经由qPCR及library分子大小的检查后,便能以Illumina cBot将RNA library注入flowcell内,经由反转录及bridge PCR反应后,即可执行测序反应,流程如下图所示。

在实验的再现性上,如下图所示,同一样品经两次FRT-seq实验所测序出来的RPKM分析结果呈现Pearson correlation为0.993,代表此技术的实验再现性是相当高的。

除此之外,FRT-seq完整保留RNA正负股的信息,如下图红色所示,基因上同一区域正股及负股皆有被测序到的比例仅占了6-7%的reads数,与目前已商品化试剂组制备的mRNA library相比较,若不经过特殊处理的mRNA library(关于能保留mRNA library正负股方向性的library制备技术,部落格后续会有文章介绍),如下图蓝色所示,其测序出来的结果无法显示RNA的方向性。

FRT-seq具有library制备快速且能保留mRNA方向性的特性,虽然如此,此技术目前仍尚未被广泛的应用,FRT-seq资料的正确性仍待更多研究资料的验证。

参考数据:

1. Mamanova L, Turner DJ. Low-bias, strand-specific transcriptome Illumina sequencing by on-flowcell reverse transcription (FRT-seq). Nat Protoc. 2011 Oct 20;6(11):1736-47. doi: 10.1038/nprot.2011.399.

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