PyroSequencing—DNA甲基化分析的金标准

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所属分类:Epigenetics

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DNA甲基化是生命发育调控的重要手段。一个人全身各处细胞中DNA序列基本一致,但是各种分化的细胞可以特异性地分化出各种功能,表观的调控起了绝大部分的作用。而表观的调控中,甲基化的修饰又是重中之重。

甲基化的检测手段已有很多,基本原理大都依赖于亚硫酸氢盐处理,把未甲基化的C转化成U,U再在后续的PCR中变成T。通过各种手段分析突定位点是C、还是T,就可以判断出这个位点是否被甲基化了。

基于PyroSequencing测序原理的测序方法,是这许多种甲基化分析中的金标准。

PyroSequencing成为甲基化测序金标准的原因:

分析的核心目标是异质性DNA甲基化的比例定量,也就是说,对于某个特定的基因位点来说,50个细胞里的总共100个拷贝中,可能只有30的拷贝是甲基化的,还有70个拷贝是没有甲基化的。现在要分析的内容就是有多少比例是甲基化的、还有多少是没有甲基化的。

PyroSequencing做甲基化分析的优点

可以针对性地对特定们置C和T两种分两个cycle分别测序,C和T之间没有信号交叉,结果清楚明了

对于C和T的比例,也就可以很方便地判定

下图是PyroSequencing测甲基化的实图

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二代测序还不能很好地测定甲基化:

Illumina平台,对测序样本要求4种碱基比较平均,这样测4种碱基的4色照片上的光点比较均一,软件比较好判别。但是亚硫酸氢盐处理过后,99%的C都变成了T,这导致T太多,而C太少。测序的效果就下降。虽然加PhiX等平衡文库可以补救一些,但是效果还不是最好。

Ion Torrent平台,对于同聚物(homopolymer,也就是一串连续的A,或一串连续的T这种序列)一直测不太准。99%的C变T之后,同聚物现象就很严重。Ion Torrent平台就测不太好。

二代测序的费用,目前还是比较高的。

Sanger法测序,对于低Allele frequency测不好

Sanger法的特点是,C和T在同一个位置出现,而因为四色荧光解析的原因,同一位置的C和T会相互干扰,这导致灵敏度的大幅下降,实际的灵敏度只能测到最低20%的Allele Frequency(100个拷贝中有几个甲基化的)

Sequenom质谱法

  • 可以测甲基化,但是要PCR,再转成RNA,再把RNA片段切断,最后上质谱
  • 过程较为复杂,还有RNA的过程(RNA易降解),可靠性就不够高

PCR方法

原理:用3'末端特异碱基的PCR引物进行PCR反应。

因为酶对引物3'末端不同的碱基有不同的亲合力,PCR的指数效应又会放大这一偏差,所以要定量的话,不一定准确

 

附PyroSequencing测序原理视频:

 


原文来自:陈巍学基因

 

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