常用的SNP检测方法

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所属分类:Genomics

SNP 是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性,在群体中的发生频率不小于1 %。包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T ,Cp G 也因此变为突变热点。

    SNP 在动物基因组中分布广泛,每一个核苷酸发生突变的概率大约为10 -9 。由于选择压力,SNP在单个基因、整个基因组中以及种群间的分布是不均匀的。SNP 在非编码区中要多于编码区,而且在编码区也是非同义突变(有氨基酸序列的改变) 的频率比其他方式突变的频率低得多。而基因间,同一种基因中的编码SNP (coding SNP ,cSNP) 的数目也不相同,可从0~29 个不等。多项研究同时发现不同种族间SNPs 的数目也是不同的,非洲人群及非裔种族中SNPs 数量最多,而其他种群的SNPs 要少得多,因此通过比较亚群间等位基因的频率将有助于阐明种族的结构和进化。

   现在SNP分型实际应用的方法有这么几种,主要看研究侧重点及经费情况,以及所要检测的位点数和样本数。

1、测序方法

这个是最原始的,也是最简单的(操作简单,工作量不小啊!)一种方法,估计各位都明白,就不再累述了!

2、Taqman探针

Taqman探针法可是一种无敌的方法,可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等等,差不多只要能用到的分子检测技术都有Taqman的身影。Taqman探针法SNP分型技术的核心就是特异性的MGB探针技术,已证实的Taqman探针,3’段结合MGB技术,能更好的进行等位基因的区分。MGB分子结合到DNA螺旋小沟,通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力,并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ),它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光,提高信噪比,从而提供检测灵敏性。

Taqman探针法还有个好处据说AB公司能提供数以万计的现成探针,只要你付得起钱就可以了,什么可将illumina SNP芯片上的所有SNP位点都检测一遍。

Taqman探针法的缺点就是探针购买太贵,一般他们的试剂盒是1500人份的,价格可以咨询AB公司在国内的总代!1000份左右标本,几个位点用Taqman还是蛮核算的。

3、Beckman SNP genome stream技术

   Beckman技术的特点就是单碱基延伸法,设计时每个位点共设计3条引物,2条是扩增引物,1条为单碱基延伸引物(这个引物也可理解为探针)。现在Beckman探针法可做到48重(也就是一次检测48个SNP位点),引物及探针的设计可以直接提交给Beckman,他们帮你有偿设计啊!Beckman的技术比较适合恰好有12个位点,48个位点检测,假如你的只有几个位点,或者恰巧不是12或48的倍数时,这个就有些不合算了!另外标本量不能太低,Beckman检测采用384板,一两百个样本那就算了吧!

4、SNPshot

SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测 SNP 设计的分析软件和试剂盒可对多个 SNP 位点同时进行基因分型 ,也被称为 minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot 反应后 ,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper 分析 ,可在 一次电泳胶 内检测 多个 SNP位点。这个平台是建立在3730,3130等PCR测序仪上的技术。

应用 SNaPshot 进行定点的序列分析 ,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的双脱氧终止法 ,所不同的是 PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个 SNP 位点的引物 3′端都紧靠SNP点 ,因此每一种引物在聚合酶作用下 ,根据模板的的序列 ,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统 ,检测延伸的那个核苷酸的种类。

5、SNP芯片

DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNA chip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上的CPU芯片相似,约1 cm2或更大些,以玻璃、硅、聚丙烯等作 为载体基片,芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”,即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后,被切成长短不一的片段,经荧光化学物质标记 后,注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关,因此通过激光扫描,即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。

前已有多家公司开展了对芯片的研究,例如美国的Affymetrix公司、NEN生命科学公司等。前者曾开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、 p53芯片等,后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外,Research Genetics公司新近开发了1个集成有1500个SNP的DNA芯片,它涵盖了人类基因组全部24条染色体,所提供的信息量至少等于或优于目前常用的 300~400个微卫星标记的图谱,检测时只需0.5μg的DNA样品就可进行1次全基因组的扫描。

另外Transgenomic公司的WAVE®核苷酸片段分析系统是高通量且较为准确可靠的筛查未知、已知SNP的新方法。利用 Transgenomic公司的WAVE®核苷酸片段分析系统进行SNP检测平均每个样本的费用为$0.5。

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