测序常见问题深度分析(四)引物降解(不纯)

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所属分类:Genomics

测序过程中,引物质量是影响测序结果的一个重要因素,由于载体测序通常使用的是载体上的通用引物,而且是由测序公司提供,因此一般不会出现问题。而 PCR产物测序使用的是个人自己设计并合成的引物,引物的质量差别很大,因此有时会出现问题。

1.引物降解

原因:引物保存不好会导致引物降解,用来测序时会导致该引物扩增出来的产物梯度性的相差一个碱基

峰图特征:在峰图上表现为一个大峰前后各有一个小峰或两个同样的小峰。伴随着整个峰图,碰到连续相同碱基信号下面无重叠峰,并信号会加强。

解决方法:重新合成引物或使用反向引物测序

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2.引物不纯

原因:引物在合成时存在质量问题,有的引物引物缺失一个或几个碱基,用来测序时会导致该引物扩增出来的产物与正常的相差一个或几个碱基,

峰图特征:

  • 整个峰图都表现为大峰后拖着一个或多个相同的小峰
  • 并在连续相同碱基时信号加强并且下面的杂峰暂时消失
  • 反向引物测序正常

解决方法:重新合成引物或使用反向引物测序并在连续相同碱基时信号加强

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并且下面的杂峰暂时消失

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