影响3730测序质量的因素

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所属分类:Genomics

  (1)  DNA模板问题(关键因素)

(a) 非特异PCR产物  

非特异PCR产物  现象:每个峰下面都有其他颜色。
原因:PCR主带与杂带混在一起测序。
对策:凝胶电泳回收主带,重新测序。

(b) 非单克隆

单克隆测序 现象:左边清晰干净;右边全部双峰,且信号强度比左边低一倍。
原因:挑克隆时,两个不同的菌落混在一起。
对策:重新挑单克隆,重新提取质粒。

 (2) 引物问题

(a) 引物碱基问题
现象a:每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。
原因:合成时,引物多了一个碱基。
对策:重新合成引物。
现象b:每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。
原因:合成时引物多了一个碱基。
对策:重新合成引物。

引物碱基问题对测序的影响

现象a                                                               现象b

(b) 引物模板不纯

引物模板对测序的影响

现象:整个峰图噪音都比较高。(区别与小片段的干扰)

原因:引物(模板)纯度太低,含有较多杂质

对策:

–建议使用HPLC(柱子纯化)或PAGE 纯化的测序引物。

–脱盐纯化的引物纯度较低,适合做普通PCR,但不建议用来测序。

(c) 引物二聚体

引物二聚体对测序的影响

现象:前面100多bp噪音高,后面正常

原因:引物二聚体未去除干净

对策:–割胶纯化

 (3) 纯化影响

DNA纯度对PCR的影响

(a) 轻微的荧光污染

现象:红色峰异常高

原因:未知大分子荧光物质污染,恰好是红色,被软件误认为红色峰。

对策:依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管;清洗或更换胶引导块、针筒。

(b) 钉子峰

现象:四色并存突然拔起的尖峰,峰形锐利。

原因:毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等,对激光全反射。

对策:–灌胶时,避免气泡产生;

–上样前,样品先离心;

–毛细管、检测窗口保持清洁;

–胶内有尿素结晶时,注意不要吸进注射器;

–样品纯化干净。

(c) 瀑布效应

现象:–基线从高处突然下降。

原因:–有机物进入毛细管,受激发产生一定波长的荧光,抬高基线。

对策:–依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管;清洗或更换胶引导块、针筒。

(4) 毛细管寿命与电泳

毛细管影响测序效果

现象:宽峰-测序峰逐渐变宽。

原因:–样品进入毛细管太多。

对策:–稀释样品浓度,重新进样。

–减少电进样(EKI)时间。

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