测序常见问题深度解析(一)双克隆

测序过程中最常见的问题是双峰,导致整个结果不可用,有时候我们也纳闷,明明挑的是单克隆,为什么还会碰到双峰呢?其实导致双峰的原因是多种的,双克隆只是其中的一原因,而且不同的起因在峰图上表现出不同的特征,通过对峰图的分析找出双峰的起因是解决问题最直接的方法。

1.双克隆(连接到载体测序)

特征:

峰图上最显著的特征是前几十bp峰形单一(与测序引物和克隆位点的距离有关,一般10-60bp),在其后的峰图出现重叠峰。

如果双向测序则两端引物测序结果都为前几十bp峰形单一,其后的峰图出现重叠峰。

原因:

如果模板中有两个克隆,它们在载体上的序列是相同的,只是插入的片段方向相反或不同,所以在使用通用引物测序时,前几十bp正常(载体上的序列),在多克隆位点后开始出现双峰。

解决方法:

重新划板,取单克隆。

测序常见问题深度解析(一)双克隆

2.双模板(PCR样品测序)

特征:峰形从一开始就比较乱

原因:首先PCR扩增出来的条带不是单一条带,并且在纯化过程中没有被分离开

解决办法:

如果扩增条带间在琼脂胶上的差异较大,可以通过割胶纯化回收的方式,一般的测序公司也会提供PCR纯化的服务,而且也就几块钱的事。

如果条带间的差异不大,则只能连接到载体上挑取单克隆测序了

测序常见问题深度解析(一)双克隆

 

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