单分子测序PacBio RS测序系统介绍

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所属分类:Genomics

PacBio RS测序系统的feature

关于读长

如果把拼接工作看作是在做拼图游戏。NGS获得的读长都很短,就好象把一幅图打成非常小的碎片,然后做拼图。由于碎片太小,因此许多碎片看起来都差不多,这样要拼出一副完整的图难度很大。PacBio RS目前可以获得1300bp的平均读长,明年初随着试剂升级,平均读长可提升至2500-3000bp,这就相当于同样的一幅图,用大的碎片来做拼图,由于大碎片比小碎片的识别度要高,因此完成拼图的难度就可以大幅降低。

关于速度和运行通量

目前PacBio上所使用的DNA聚合酶的合成速度大概是1-3个碱基/秒,由于在该平台上,聚合酶合成的过程就是序列解读的过程,这意味着测序速度每分钟可超过100个碱基。从样品制备到获得碱基序列的全部流程可在1天内完成。

如果使用C2试剂,每个SMRT cell可以获得90M 的可定位数据。现阶段每天最多可运行12个SMRT cell,因此每天可获得的数据是12×90=1080Mb

单分子测序PacBio RS测序系统介绍

关于准确性

“PacBio平台上目前的错误主要是插入和缺失,只有大概1%是substitution。缺失错误源自于有时候碱基掺入速度过快,超过了PacBio相机的拍摄帧数。插入错误源自于有的时候酶随机的选择一些碱基,但并未将这些碱基真的掺入。合成链中。由于这些错误是随机的,因而可以随着测序覆盖深度的增加而消除。因此,尽管PacBio的单分子单次读取的原始准确度并不非常高,但随着测序覆盖深度的增加,它可以获得比NGS平台更高的一致性准确度。

关于价格和市场

你不能只看单价,或者单次运行的成本,因为不是运行结束,软件自动出来的结果就可以打印发表。如果考虑到长读取的优势和在数据拼接上能节省的时间和费用,PacBio RS有其他方法不可比拟的优势。关键是它是否能满足你的需要,帮助你快人一步达到目标。

现阶段PacBio平台和NGS平台更多的是一种互为补充的关系,NGS可以获得更多的数据量,而PacBio可以获得更多的信息量。

单分子测序PacBio RS测序系统介绍

PacBio RS测序系统的应用

甲基化分析

甲基化研究如今开展得如火如荼。除了人们熟知的5-mC,另一种修饰方式——5-mC的羟基化形式5-hmC也引起人们注意。但现有的测序方法如亚硫酸氢盐测序,无法区分5-mC和5-hmC。美国芝加哥大学利用第三代单分子SMRT测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。通过聚合酶动力学带来的宝贵信息,研究人员可直接检测DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。

相关论文:Chun-Xiao Song, Tyson A Clark, Xing-Yu Lu, Andrey Kislyuk, Qing Dai, Stephen W Turner, Chuan He and Jonas Korlach. (2010) Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Methods 9, 75–77 (2012) doi:10.1038/nmeth.1779

高GC含量区域测序

美国加州大学戴维斯分校医学院利用单分子实时测序技术,对脆性X染色体综合征的关键基因FMR1中的CGG三核苷酸重复区域进行了测序。般CGG重复在200次以上,被认为是具有临床意义的,但这个长度不管对于Sanger法测序或者新一代测序来说,都是很困难的,而PacBio则很好的解决了这个问题。

相关论文:

Oostra BA, Willemsen R. Biochim Biophys Acta. FMR1: a gene with three faces. 2009 Jun;1790(6):467-77. Epub 2009 Feb 21.

 Eid, J., et al., Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.

病原微生物鉴定

由于PacBio从样本制备到获得序列信息所需时间非常短(<1天),在具有时效性的病原微生物鉴定中(例如生物反恐、流行病爆发监控等)也非常有优势。一个国际小组利用Pacific Biosciences的单分子测序技术,深入研究了欧洲大肠杆菌菌株的致病性和进化起源,该研究成果发表在《新英格兰医学杂志》上。

相关论文:

David A. Rasko et al. Origins of the E. coli Strain Causing an Outbreak of Hemolytic–Uremic Syndrome in Germany.  Engl J Med 2011; 365:709-717August 25, 2011DOI: 10.1056/NEJMoa1106920

稀有突变检测

二代测序检测的是经过 PCR 扩增后的大量分子的总信号,一方面 PCR 扩增过程中的错配等,会变成系统误差影响最终的测序结果。另一方面,稀有变异在扩增过程中,很容易被淹没在群体中而无法被检出。 PacBio无需扩增、对每一个单分子模板都进行评估,对于混合群体中低至 1/100的稀有突变都可以检出。

以上是根据生物通以及网上一些资料整理,原文以及更多关于Pacbio RS 测序原理与应用方面的介绍请阅读下面的资料:

ybzhao

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