使用Misa结合Primer3来批量设计SSR引物

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所属分类:Bioinformatics

MISA,英文全称为MIcroSAtellite identification tool,即微卫星识别工具。虽然前段时间看到PLoB上已经有一篇文章《利用MISA鉴定简单重复序列(SSR)》来介绍MISA脚本的使用,今天在陈连福的博客上发现也有一篇介绍MISA的文章,所以转载过来,与大家一起分享。

MISA是使用 perl 编写的一支程序,能识别出序列中的微卫星和复合微卫星(两个微卫星之间由由不多于100bp的碱基对隔开),并给出其所在位点。

MISA下载网址:http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html

MISA用法:

$ misa.pl filename
misa.pl <FASTAfile>

其中,fastfile是序列文件,同时在运行程序的工作目录下必须有一个名称为“misa.ini”的文件。该文件内容为:

definition(unit_size,min_repeats): 1-10 2-6 3-5 4-5 5-5 6-5
interruptions(max_difference_for_2_SSRs): 100

该文件指定了misa的参数,即1个碱基重复10次及10次以上;2个碱基重复6次及6 次以上; 3个碱基重复5次及5次以上;4个碱基重复5次及5次以上;5个碱基重复5 次及5次以上;6碱 基重复5次及5次以上,这样的碱基重复序列才算是微卫星序列。 同时,两个微卫星之间的距 离小于100bp的时候,两个微卫星组成一个复合微卫星。

MISA的输出结果:

MISA会在 Fastafile 所在的文件夹下生成两个文件,分别是 “<FASTfile>.misa” 和 “<FASTfile>.statistics”

"<FASTfile>.misa" :以表格的形式列出微卫星的类型和位点;
"<FASTfile>.statistics" :统计微卫星的类型和频数。

在MISA的下载页面中,提供了3个附加的 perl 脚本,分别是:Get_est_trimmer.plp3_in.pl 和 p3_out.pl

Get_est_trimmer.pl

针对EST序列,可以除去EST序列中短的序列和两端不明确的碱基。

p3_in.pl

输入 misa.pl 的输出结果,将引物设计的参数文件(模板,产物长度,目标区域等)导入到一个以“p3in”为后缀的文件中。

$ p3_in.pl filename.misa

 调用 primer3_core

该软件详细解说见:《primer3引物设计详解》,生成结果文件 filename.p3in。

 $ primer3_core -default_version=1 -output=filename.p3out filename.p3in

 p3_out.pl

对primer3产生的文件进行提取合,得到最后的结果文件 filename.result

$ p3_out.pl filename.p3out filename.misa

p2_in.pl 和 p3_out.pl 这两支程序需要修改才能正常使用。

p2_in.pl

[perl]
#!/usr/bin/perl

use strict;

open (IN,"<$ARGV[0]") || die ("\nError: Couldn't open misa.pl results file (*.misa) !\n\n");

my $filename = $ARGV[0];
$filename =~ s/\.misa//;
open (SRC,"<$filename") || die ("\nError: Couldn't open source file containing original FASTA sequences !\n\n");
open (OUT,">$filename.p3in");

my $in = join "", <IN>;
study $in;

#print "$in\n";

my $count;

while (<SRC>)
{
my $id = $_;
$id =~ s/^>(\S*)/$1/;
$id =~ s/\s+/_/;
$id =~ s/\n//;
# print "$id";
my $seq = <SRC>;
$seq =~ s/[\d\s>]//g;#remove digits, spaces, line breaks,...
# print "$seq\n";
while ($in =~ /$id\t(\d+)\t\S+\t\S+\t(\d+)\t(\d+)/g)
{
my ($ssr_nr,$size,$start) = ($1,$2,$3);
$count++;
print OUT "SEQUENCE_ID=$id"."_$ssr_nr\nSEQUENCE_TEMPLATE=$seq\n";
print OUT "PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=100-280\n";
print OUT "SEQUENCE_TARGET=",$start-3,",",$size+6,"\n";
print OUT "PRIMER_MAX_END_STABILITY=250\n=\n"
};
};
print "\n$count records created.\n";
[/perl]

p3_out.pl

[perl]
#!/usr/bin/perl

use strict;

open P3OUT, '<', "$ARGV[0]" or die ("\nError: Couldn't open Primer3 results file (*.p3out) !\n\n");
my $filename = $ARGV[0];
$filename =~ s/\.p3out//;

open IN, '<', "$ARGV[1]" or die ("nError: Couldn't create file !\n\n");
open OUT, '>', "$filename.results" or die ("nError: Couldn't create file !\n\n");

my $count = 0;
my $count_failed = 0;

print OUT "ID\tSSR nr.\tSSR type\tSSR\tsize\tstart\tend\t";
print OUT "FORWARD PRIMER1 (5'-3')\tTm(°C)\tsize\tREVERSE PRIMER1 (5'-3')\tTm(°C)\tsize\tPRODUCT1 size (bp)\tstart (bp)\tend (bp)\t";
print OUT "FORWARD PRIMER2 (5'-3')\tTm(°C)\tsize\tREVERSE PRIMER2 (5'-3')\tTm(°C)\tsize\tPRODUCT2 size (bp)\tstart (bp)\tend (bp)\t";
print OUT "FORWARD PRIMER3 (5'-3')\tTm(°C)\tsize\tREVERSE PRIMER3 (5'-3')\tTm(°C)\tsize\tPRODUCT3 size (bp)\tstart (bp)\tend (bp)\n";

my $in = join "", <IN>;
my $p3out = join "", <P3OUT>;

close IN;
close P3OUT;

study $in;

my @p3out = split /=\n/, $p3out;

#print $in;
#print @p3out;

foreach ( @p3out ) {
my ($id,$ssr_nr) = (/SEQUENCE_ID=(\S+)_(\d+)\s*?\n/);
# print "$id\n$ssr_nr\n"

$in =~ /($id\t$ssr_nr\t.*)\n/;
my $misa = $1;
# print "$misa\n";

/PRIMER_LEFT_0_SEQUENCE=(.*)\n/ || do {$count_failed++;print OUT "$misa\n"; next};
my $info = "$1\t";

/PRIMER_LEFT_0_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_0=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_RIGHT_0_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_0_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_0=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";

# print "$info\n";

/PRIMER_PAIR_0_PRODUCT_SIZE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_0=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_0=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_LEFT_1_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_1_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_1=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_RIGHT_1_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_1_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_1=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_PAIR_1_PRODUCT_SIZE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_1=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_1=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_LEFT_2_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_2_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_2=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_RIGHT_2_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_2_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_2=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";

/PRIMER_PAIR_2_PRODUCT_SIZE=(.*)/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_LEFT_2=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
/PRIMER_RIGHT_2=(\d+),\d+/; $info .= "$1";

$count++;
print OUT "$misa\t$info\n"
}

print "\nPrimer modelling was successful for $count sequences.\n";
print "Primer modelling failed for $count_failed sequences.\n";
[/perl]

本文来自陈连福的博客:http://www.hzaumycology.com/chenlianfu_blog/?p=255

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目前评论:10   其中:访客  10   博主  0

    • avatar fengshl 0

      谢谢分享
      另外我在用p3_in.pl处理misa结果的时候,生成的目标文件非常大,请问这个是正常的吗?

        • avatar smlyt413 0

          @fengshl 我也遇到了这种情况,生产的目标文件非常大,感觉是无限循环一样。请问您解决了吗?

            • avatar 年小黑 0

              @smlyt413 恩,而且处理的结果是第一个序列的无限循环,跪求大神修改程序呀

          • avatar 凝曦-SSR 0

            为什么p3_in.pl运行后的结果文件.p3in没内容,0kb。运行时并没有错误提示

              • avatar 请输入您的QQ号 0

                @凝曦-SSR 请问你后面是什么处理好的?

                • avatar 阿土 0

                  @凝曦-SSR 0字节是什么原因?我也遇到这种情况,怎样解决?

                    • avatar 周润南 1

                      @阿土 同问

                    • avatar 周润南 1

                      @凝曦-SSR 请问您是怎么解决的啊

                        • avatar 请输入您的QQ号 0

                          @周润南 你好!你解决了P3-in的问题了?