Primer Premier 5.0引物设计

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PCR引物设计
⑴ 确定PCR产物片段大小(product length);
⑵ 确定引物所在区段;
⑶ 确定引物序列的长度范围(primer length );
⑷ 确定引物Tm值(melting temperature)范围,Tm=4(G C) 2(A T)。

一、PCR引物设计原则

  • 引物长度以15-30bp为合适的,最常用的是18-24bp;
  • 引物里面的GC含量在40-60%之间是最好的;
  • 引物里面的ATCG分布应遵守随机性,避免连续出现4个以上的单一的碱基,尤其在引物的3端不应该出现连续的G/C;
  • 引物要求自身不能含有互补序列,否则这个引物自身会形成发夹一样的二级结构,影响PCR作用效果;
  • 两个引物之间不应该有多于4个的互补/同源的碱基,否则会形成引物二聚体;
  • 引物的3\' 端是G/C。

二、Primer Premier 5.0软件设计引物

Primer Premier是由Premier公司开发的、专业用于PCR引物及杂交探针的和评估的系列软件,基本上目前引物设计都是基于Primer系列,如ncbi在线引物设计是基于Primer 3。

三、引物设计步骤
①输入序列:安装好软件后,首先打开软件,左上角来操作,file-new-dna sequence,这一项可以把复制的序列粘贴进去,也可以选择另一个file-open-dna sequence去open一个新的文件。②点击Primer进入引物设计界面。③点击引物设计界面上的search按钮进行搜索选项设定。④点击搜索选项界面上的OK按钮可得到引物设计结果。⑤选择分值高的引物对作为实验合成引物选项。⑥根据需要对引物进行编辑。
Primer Premier 5.0引物设计

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