Q-PCR(Real-time PCR)

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实时聚合酶链锁反应(Real-time polymerase chain reaction,简称为Real-time PCR),又称定量实时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,简称为Q-PCR)。Q-PCR是藉由PCR扩增原理将DNA放大的同时并达到实时定量之结果,若使用传统PCR方法来定量的话是较费时费工又容易污染,因此Q-PCR已经广泛使用在定量这方面。

目前Q-PCR常用化学物质大致上可以分为:非专一性化学物质(SYBR Green )与专一性化学物质(TaqMan probe)。分述如下:

1.SYBR Green I

SYBR Green I是与双股DNA的minor groove结合释放出荧光,因此在PCR过程中可在每一cycle的extension步骤结束时测量荧光的强弱,就可知每PCR cycle中产生了多少PCR product。但要特别注意的一点,SYBR Green I会跟所有的双股DNA结合,所以无法分辨特异性产物与非特异性产物,在这方面来说也是SYBR Green I的缺点。

2. TaqMan probe (hydrolysis probe)

TaqMan probe是一条人工合成oligonucleotid,在oligonucleotid的两端分别标记上不同的荧光物质,5’端荧光称为reporter而3’端荧光称quencher。假如probe在游离状态时,reporter及quencher的交互作用会互相遮蔽对方的荧光以达到不会发光,当DNA复制时probe被hydrolysis后,reporter与quencher会分开来,而quencher就失去可以遮蔽reporter的效果,则使reporter发光被侦测到。同样的,probe是特异性的与Tag的片段结合,因此不会侦测到非特异的产为,在这部分来说是TaqMan probe的优点。

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