各种PCR介绍

  • A+
所属分类:Glossary

PCR可以说是目前分子生物学实验中应用最为广泛的一种技术。从最初的在几个水浴锅里把试管放来放去,到现在各种先进的PCR仪, 到REAL TIME PCR。 设备是越来越先进,方法是越来越多,但基本的原理还是那套。

一、增效 PCR ( booster PCR )

当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题:一是形成引物二聚体,一是非特异扩增,消耗了引物和酶,而特异扩增片段产量降低。对于这种情况,可设置二步PCR,先用较低浓度的引物进行初级PCR,此时由于引物少,形成引物二聚体的可能减少,但它并不影响靶序列的扩增,只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充引物量,以初级PCR产物为模板进行扩增,靶序列的产量将相应增加。

 

二、巢式 PCR ( nested PCR )

巢式PCR也是进行二步PCR,与增效PCR不同的是,第二步PCR需应用另外的PCR引物,并另行设置反应体系,此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧,用初级PCR产物做模板,进行第二步PCR,这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。巢式PCR除了达到增效PCR同样的目的外,还提高了最终产物的特异性。一般应用于动物方面。如:病毒,梅毒螺旋体,HIV,肿瘤基因等

 

三、多重 PCR(multiplex PCR)

一般 PCR 仅应用一对引物,通过 PCR 扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定 . 多重 PCR ,又称多重引物 PCR 或复合 PCR ,它是在同一 PCR 反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的 PCR 反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般 PCR 相同 . 多重 PCR 技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性,而是在于其多对引物的设计,必需保证多对引物之间不形成引物二聚体,引物与目标模板区域具有高度特异性。

应用于基因诊断,对与疾病相关的基因(庞大)进行扩增检测。

 

四、标记 PCR(Labelled Primers , LP-PCR) 和彩色 PCR(Color Complementation assay PCR , CCAPCR)

LP-PCR是利同位素或荧光素对PCR引物的5"端进行标记,用来检测靶基因是否存在. CCAPCR是LP-PCR的一种.它用不同颜色的荧光染料;标记引物的5"端,因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5"的染料,通过电泳或离心沉淀,肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况,此法可用来检测基因的突变,染色体重排或转位,基因缺失及微生物的型别鉴定等.

 

五、逆转录 PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

逆转录PCR,指的是以mRNA为模板,经逆转录酶作用获得与mRNA互补的DNA链,即cDNA,然后以cDNA链为模板进行PCR反应。

 

六、不对称 PCR(asymmetric PCR)

PCR的扩增是双链DNA的2条链,而DNA序列分析只需要其中一条链即可。因此有人设计了不对称PCR(asymmetric PCR)用于产生单链DNA。

原理:2个寡核苷酸引物的含量不同,其浓度比为50:1或100:1,前12个循环两条模板等量扩增,之后低浓度引物消耗殆尽,其扩增产物减少以至于无;而高浓度引物介导产生的扩增产物(即单链DNA)逐渐增加,可得到大量单链DNA(ssDNA)用于直接测序。

 

七、反向 PCR(inverse PCR)

反向PCR用于扩增已知序列两端的DNA序列。

基本方法:选择一个在已知序列中没有,而在其两侧都存在的限制性内切酶位点,用相应的限制性内切酶切割,将酶切的片段在连接酶的作用下环化,使得已知序列位于环状分子上,根据已知序列的两端序列设计两个引物,以环状分子为模板进行PCR,就可以扩增出已知序列两侧的未知序列,由于引物方向与正常PCR所用的正好相反,故称反向PCR。

 

八、锚定 PCR(anchored PCR , A-PCR)

先合成cDNA,并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3'-可变区末端加上一个PolyG尾巴,所用引物是具5'-polyC尾巴,可以与PolyG尾巴结合,是一个固定点,无论其余部分序列如何,只识别片段末端,由此进行PCR扩增,叫锚定PCR 。锚定PCR主要用于分析具有可变末端的DNA序列.

 

九、差别 PCR(differential PCR)

差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中,用同一套引物进行扩增,电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。

 

十、差示反转录 PCR[mRNA 差异显示技术 ] ( differential display of reverse transcriptional PCR , DDRT-PCR )

mRNA差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年创立的。mRNA 差异显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA 指纹图谱技术,具有简便、灵敏、RNA 用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品,该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。其基本原理是,几乎所有的真核基因mRNA分子的 3' -末端,都带有一个多聚的腺苷酸结构,即通常所说的poly(A)尾巴。因此,在RNA 聚合酶的作用下,可按mRNA为模板,以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子 3' -末端序列末端结构的分析可以看到,在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基,除了为A的情况之外,只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征,P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物,它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个 3' -末端锚定脱氧核苷酸组成,用 5' -T 11G 、 5' -T 11C 、 5' -T 11A 表示,这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA 群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是,采用这三种引物,可以将整个mRNA 群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增,因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的,可以在测序胶上明显分辨开来,从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。

随着mRNA差异显示技术的广泛应用,也逐渐显露出一些不足之处,如所得特异性cDNA片段克隆的假阳性的比例较高,差异条带分离困难,获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp太短之间,包含大量的非编码序列,不利于同源性比较分析等。

 

十一、原位 PCR(In situ PCR)

原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR,对细胞中的靶DNA进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。基本步骤:组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测

优点:灵敏度高,可进行细胞内定位

 

十二、荧光定量 PCR(FQ-PCR)

荧光定量PCR:融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团),结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针,PCR过程中,具有5'→3'外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时,将DNA探针逐个降解,释放出荧光报告基团,这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。

 

十三、免疫 -PCR(immuno-PCR)

免疫-PCR是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原,尤其适用于极微量抗原的检测.

免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应,②与嵌合连接分子结合,③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中,嵌合连接分子起着桥梁作用,它有两个结合位点,一个与抗原抗体复合物中的抗体结合,一个与质粒DNA结合,其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似,不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA,在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物,通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.

免疫PCR优点为:①特异性较强,因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高,PCR具有惊人的扩增能力,免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上,可用于单个抗原的检测.③操作简便,PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多,一般实验室均能进行.

 

十四、 SOE-PCR ( Gene splicing by over lap extension )和 SDL-PCR ( Gene splicing by directed liga- tion )

1989年,Horton等人提出了SOE法,即通过复制时DNA链的交错延伸实现基因拼接。本法可分四步进行。

(1)引物设计:引物a和d是常规引物;b的左半段为常规引物,右半段为基因Ⅱ的引物序列;c同理;则b和c的部分碱基可互补配对。

(2)基因I、Ⅱ分别扩增,产物相应为片段A、B和C、D。

(3)两种产物混合,经变性及退火处理,A链和D链部分碱基互补配对,成杂交链。

(4)在DNApolymeraseI作用下,A和D链互为引物和模板,合成出A"D"链,即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列,则在接接产物中,将按预先设计要求出现定点突变。

1991年下半年,Lebedenko等人提出SDL方法,即直接拼接法,它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下:

(1)限制性内切酶,EcoRI核酸内切酶(或其它Ⅱs类限制性内切酶)能专一性识别 6bp的非回文序列,并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸,产生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5"末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关, 而是由切点附近的序列决定的。

(2)扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例:5"链引物包括常规5" 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列;3"链引物包括常规3"链引物和AC及EcoRI 识别位点。

(3)唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5,它的右侧突出末端TCAC中,TC为原始exon5的一部分,AC为原始exon6的一部分,且TCAC与 exon6的AGTG互补配对,其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259,故可被视作 “唯一性末端”。

(4)把经扩增的exon5、exon6和exon7混合,依据碱基互补配对原则,它们就能按顺 序依次拼接。

显而易见,在SOE法中,退火时的最希望产物是AD,杂交链,但A链和B链,C链和D链 配对的可能性更大,另外还有B、C链的配对,这些都是不利的;而SDL法中就不存在 这个问题。另一方面,由于不需DNApolymeraseI,避免了它在复制中可能带来的错 误,所以,SDL法更优越。

 

十五、 RACE-PCR(Rapid Amplification of cDNA Ends PCR)

经典的RACE技术是由frohman等(1988)发明的一项技术,RACE是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。使用此方法的要求是必须知道至少23-28个核苷酸序列信息,以此来设计 5' 末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)。

 

十六、融合 PCR ( fusion PCR )

采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来,此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。

 

十七、 TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)

由IJiu等设计的TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR,能有效控制由随机引物引发的非特异产物的产生,可成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列,从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成:(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同一特异性弓l物扩增出的产物;(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中,其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer,简称sp1,sp2,sp3,约20bp),用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerate prime,AD,约14bp)相组合,以基因组DNA为模板.根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物(流程如图5所示)。TAIL-PCR共分3次反应。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应,使sp1与已知的序列退火并延伸,增加了目标序列的浓度;1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上;10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火,随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物:特异性产物(I)型和非特异性产物(Ⅰ型和Ⅲ型)。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板,通过10次热不对称的超级循环,使特异性产物被选择地扩增,而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板,再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环,通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

 

十八、简并 PCR ( Degenerate PCR )

在某个位置用两种以上的碱基代替原来的单碱基渗入oligo链,合成的是一堆混和物,实际上能够起作用的在其中占一定比例,这个比例一般用简并度表示。比如agctN合成的时候最后一位用4种碱基,反应真正用的agctc,占总数的1/4,agctNN其中agctCC就占1/16,一般公司推荐3‘端尽可能少的简并,而且有效引物在总数中不能低于一定比值,简并太多宁可多设计几条引物,也有用次黄代替AGCT四种的,不过价格昂贵,一般很少用。

 

十九、菌落 PCR ( Colony PCR )

可不必提取基因组DNA,不必酶切鉴定,而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增,省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。

 

二十、 TouchdownPCR

是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度,直至达到“Touchdown”退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异(每摄氏度造成4倍差异)。因此相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集
该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。具体过程如下:使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物,这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列,5'和3'引物各长18个碱基(6个氨基酸),两者之间有一个碱基以上的间隔。使用简并引物即可以进行“TouchdownPCR”。由这种方法将获得大量的产物,但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离,所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。如果克隆和测需一打PCR产物,将可以确定肽的正确编码序列,设计进行杂交的寡核苷酸等。该技术特别适用于由Ser,Lys和Arg(每个有6个密码子)构成的多肽。

avatar

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: