ChIP技术

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原理:

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联,超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体,从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。染色质免疫共沉淀是理解染色体的一种革命性工具,使研究者了解染色质及其相结合的调控因子之间的时空动态相互作用。

ChIP实验流程:

ChIP实验流程具体操作步骤包括:

第一步、细胞的甲醛固定

交联所用的甲醛终浓度约为1%,而交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。通常的交联条件为室温10 min。

第二步、超声波断裂染色质

甲醛交联后的染色质对限制酶和DNase I高度抵抗,因此通常使用超声使得染色质断裂。超声波是使用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时,要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证低温。总超声时间也不要太长,以免蛋白降解。打断后的染色质片段的长度主要集中在200-1000bp左右(可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定)。

第三步、用特异性抗体与目的蛋白结合,免疫沉淀蛋白和DNA复合物。

抗体的量要进行优化,防止非特异的结合。用Protein-A/G Sepharose回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合的染色质。

第四步、65℃解交联蛋白质和DNA复合物,消化蛋白质,纯化富集的DNA。

在免疫沉淀复合体中加人不含DNase的RNase和蛋白酶K,65℃保温6h以上,使交联逆转。交联逆转后用QIAquick DNA cleanup system纯化回收DNA。纯化的DNA极少,可用NanoDrop? ND-1000仪定量。

问答:

在免疫共沉淀中加入ProteinA/G的作用及具体原理是什么?

主要是“捕获”抗体,形成复合物,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的,因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。

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